Dag 4

Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.

Resultat

 Resultatet efter southern blot blev detta:









Raden längst till vänster motsvarar den klyvda plasmiden med högst koncentration och raden i mitten den klyvda med lägre koncentration. Längst till höger visas den oklyvda plasmiden.  Man kan här tydligt se att vi har lyckats med vårt försök då vi har fått ett tydligt band på båda klyvningar och på samma ställe. På klyvningen med högst koncentration kan man även se flera band som tyder på att det har klyvts på flera ställen i provet än just där vår gen fanns. Detta syns inte på klyvningen som hade lägre koncentration. 

Den oklyvda reaktionen visar på flera olika band vilket betyder att vi har fått flera ospecifika bindningar där men vi ser även ett tydligt band där vi har vår plasmid, jämför med bilden från gelelektroforesen nedan där man ser ett band på samma ställe från PCR reaktionen som här.

Resultatet efter PCR och gelelektrofores blev detta:

 
Om man jämför metoderna så tar Southern längre tid än vad PCR gör men den ger ett tydligare resultat eftersom vi kan se flera band efter Southern än med PCR. PCR är också väldigt känslig för kontamination vilket är en nackdel. Eftersom Southern sker i så många steg finns risk för många felkällor man måste därför vara väldigt nogrann när man utför denna metod.

Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen? 

Det viktigaste jag lärt mig är att vara noggrann och att komma förberedd till laborationerna. Det var kul att lära sig en ny metod, Southern blot. Det var bra att vi fick arbeta självständigt i labbet det gjorde att man lärde sig att planera hur ens dag skulle se ut.

Dag 2

Idag har du utfört en PCR.
Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?


Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades?


Efter utförd elektrofores blev resultatet som på bilden nedan:

Den negativa kontrollen visar att det inte blivit någon carry-over kontamination och då kan man lita på resultaten. Markör III blev ganska svag och det berodde på att när jag pipetterade ned i brunnen råkade jag komma för långt ner och hade därmed sönder brunnen :( därav kan man inte använda sig av den. Även den andra markören visar konstiga utsmetade band vilket kan ha berott på att någonting i gelen var fel, någon pulverbit hade kanske inte blivit helt upplöst. Plasmidpreparationen, P visar ett tydligt band på rätt ställe och vi kan därmed säga att reningen blivit lyckad. Ett svagt band syns ovanför detta band och det kan vara plasmider som är "open-circle DNA" dvs dessa vandrar inte lika långt över gelen då de inte är formade på samma sätt som den andra plasmiden som är "closed coiled circle". PCR reaktionen har lyckats men det vita stora fältet tyder på många ospecifika produkter. Dvs primerparet har bundit på flera ställen än till målsekvensen. Detta kan ha berott på att de har stått framme för länge eller att man har fått mer av den ena primern och mindre av den andra. Däremot syns det ett tydligt band på samma ställe som den positiva kontrollen har sitt band vilket betyder att genen LL37 finns i vårt prov. Jippie :)
 

Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Jag skulle vilja se en bild på ett bättre resultat än vårt efter elektrofores så att man kan jämföra hur det egentligen skulle ha sett ut. Jag tyckte det var jättebra att vi själva fick planera vår dag med raster och i vilken ordning vi gjorde alla moment.  

Hej klassen ! 

Efter en heldags laboration med rening av en rekombinant plasmid från bakterier har vi kommit fram till detta:

1. Idag har du renat en rekombinant plasmid från en bakteriesuspension.
Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?

Förhoppningsvis är det bara plasmider kvar nu, det visar sig efter de kommande laborationerna. Det som ska ha tagits bort är proteiner, lipider, RNA, genomiskt DNA m.m

2. Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?

Efter mätning av koncentrationen i spektrofotometern fick vi fram att den blev 0,39 mikrogram/mikroliter. Kvoten mellan absorbansen för 260 nm och 280 nm blev 1,73. Rent DNA ska ligga ungefär på 1,8 men alla värden mellan 1,6 och 2,0 är acceptabla. Vi har alltså lyckats bra. En kvot på över 2,0 skulle kunna tyda på att det finns RNA kvar i provet och en kvot på under 1,6 skulle kunna tyda på att det ev. finns proteiner kvar i provet.

3. Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labbdag eller vid labuppföljningen?

Nej jag har förstått det mesta hitills, antar att de andra dagarnas laborationer klarnar mer när man väl håller på att laborera.