Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?
Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades?
Efter utförd elektrofores blev resultatet som på bilden nedan:
Den negativa kontrollen visar att det inte blivit någon carry-over kontamination och då kan man lita på resultaten. Markör III blev ganska svag och det berodde på att när jag pipetterade ned i brunnen råkade jag komma för långt ner och hade därmed sönder brunnen :( därav kan man inte använda sig av den. Även den andra markören visar konstiga utsmetade band vilket kan ha berott på att någonting i gelen var fel, någon pulverbit hade kanske inte blivit helt upplöst. Plasmidpreparationen, P visar ett tydligt band på rätt ställe och vi kan därmed säga att reningen blivit lyckad. Ett svagt band syns ovanför detta band och det kan vara plasmider som är "open-circle DNA" dvs dessa vandrar inte lika långt över gelen då de inte är formade på samma sätt som den andra plasmiden som är "closed coiled circle". PCR reaktionen har lyckats men det vita stora fältet tyder på många ospecifika produkter. Dvs primerparet har bundit på flera ställen än till målsekvensen. Detta kan ha berott på att de har stått framme för länge eller att man har fått mer av den ena primern och mindre av den andra. Däremot syns det ett tydligt band på samma ställe som den positiva kontrollen har sitt band vilket betyder att genen LL37 finns i vårt prov. Jippie :)
Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labdag eller vid labuppföljningen?
Jag skulle vilja se en bild på ett bättre resultat än vårt efter elektrofores så att man kan jämföra hur det egentligen skulle ha sett ut. Jag tyckte det var jättebra att vi själva fick planera vår dag med raster och i vilken ordning vi gjorde alla moment.
Då har ni jobbat bra, vi glömde att använda filterspetsar när vi tillsatte våra lösningar i icke rent rummet :(. Jag vet inte riktigt varför vi fick använda Markör III alls eftersom den inte finns med i listan av lämpliga markörer i den frivilliga övning vi fick om optimering av LL37 gen. Även i labbkompendiet visar den sig vara ganska svag och suddig i storleksområdet för LL37. Däremot är den lämplig för att visa plasmidstorleken. Den skulle ha varit omkring 3,5 kbp och då sitter era band för (antagligen) cccDNA också lite för lågt (omkring 2 kbp så som det ser ut). Jag tycker Markör III inte var helt lämpligt för den elektroforesen så att brunnen gick sönder blev inte någon stor katastrof :).
SvaraRaderaOch ja, den andra markören ser ut som om den hade förflyttat sig lite för snabbt men om man tänker att positiva kontrollen och PCR produkten visar banden i samma höjd så blev resultaten ändå ganska bra. Men vad jag tycker är konstigt, är att ni fått ett så svagt band för er PCR produkt. Kanske det är normalt, men det fanns kanske inte tillräckligt med templat i ert prov innan PCR eller kunde eran beräknade koncentration från absorbansmätningen varit för hög? Ni hade visst en bra kvot men absorbansen vid 260 kunde också ha kommit från genomiskt DNA. Det kunde förklara de ospecifika produkter som ser ut som delar av genomiskt DNA men jag är ingen expert och det är bara lite spekulation. Förhoppningsvis kommer ISH ge ett mer tydligt svar.
Ja det där med för lite templat kan nog stämma, Annica sa att någonting var lite knas med den... Jag funderar på om vi ändå hade kontamination i provet eftersom den negativa kontrollen inte är helt svart .... :S Hmm vet inte
SvaraRaderaHej när du pippiterar ner i brunnarna så försök att inte ta ner spetsen i själva brunnen. Det räcker med att ta den ovanför så går det ner i brunnen, det här tipset hjälpte mig i alla fall :) tur att det bara var markör III som blev så då. Jag tror inte att det var någon pulverbit som påverkade markör IX, det ser mer ut som att den är lite otydlig. Kanske för att den hade legat länge utan kyla? Eller kanske hann den avdunsta lite innan ni pippiterade ner i brunnarna? Annars ser det ut som era labbdagar har gått bra :)
SvaraRadera